Campania naţională de prevenire a gripei aviare

pentru medici

Prelevarea, conservarea şi transportarea probelor de laborator

Metodologia de recoltare, păstrare şi transportare a probelor de la pacienţii care pot avea infecţia gripală A (H5N1) şi de la cazurile suspecte sau confirmate de VGA A (H5N1) este stipulată în detalii în ghidul elaborat de către Ministerul Sănătăţii al Republicii Moldova şi Centrul Naţional Ştiinţifico-Practic de Medicină Preventivă ,,Gripa aviară – particularităţi etiologice, clinico-epidemiologice, de evoluţie, diagnostic, tratament şi profilaxie”, care întruneşte cerinţele Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii la acest compartiment (în prezent este la etapa de editare) şi menţionate în ghidul pentru operatorii de teren „Collecting, preserving and shipping specimens for the diagnosis of avian influenza A(H5N1) virus infection. Guide for field operations”. http://www.who.int/csr/resources/publications/surveillance/WHO_CDS_EPR_ARO_2006_1/en/index.html

Recoltarea, conservarea, etichetarea, ambalarea şi transportul probelor pentru identificarea virusului gripal A (H5N1 sau alte variante) de la toate cazurile posibile vor fi efectuate de către persoane bine instruite conform precauţiilor standard. Toate manipulările, se vor face în condiţii de maximă securitate în baza recomandărilor OMS.

Pe această pagină sunt prezentate unele momente-cheie privind recoltarea, stocarea şi transportarea probelor.

Recoltarea (prelevarea) probelor

Probele vor fi prelevate în IMSP Spitalul de Boli Infecţioase „T. Ciorbă” care serveşte drept instituţie medicală de referinţă pentru pacienţii investigaţi pentru gripa A (H5N1). Ele se vor expedia în maximum 48 de ore la Laboratorul Infecţii Respiratorii Virale.

Toate persoanele, precum şi probele recoltate de la ele sunt considerate ca potenţial infecţioase, astfel personalul care are contact cu aceştia / aceste este obligat strict să respecte măsurile de protecţie ca să minimalizeze expunerea. Folosirea echipamentului personal de protecţie este obligator pentru toate persoanele implicate în procedurile de recoltare, etichetare, ambalare şi transportare a probelor. Echipamentul individual de protecţie include:

• masca facială N95/FFP2;
• mănuşi de latex nesterile (sau echivalente pentru cei alergici);
• ochelari de protecţie sau scut facial;
• halat cu mâneci şi manşete lungi, şi bonetă sau salopetă cu glugă;

Posibil să fie necesar şi

• sorţ impermeabil;
• cizme potrivite de cauciuc.

Indicaţii generale pentru recoltarea probelor:

• O listă de verificare pentru toate stadiile de recoltare, manipulare şi transportare a probelor trebuie să fie completată pentru fiecare lot de probe şi păstrate pentru referinţă.
• Pentru fiecare tip de probă (ex. - tampon nazal; aspirat nazo-faringian) se vor preleva două probe în recipiente separate. Una se foloseşte la testarea imediată, iar a doua se păstrează pentru testarea repetată sau ca probă de referinţă.
• Fiecare persoană care va fi testată sau fiecare probă trebuie să aibă un număr unic de identificare. În aşa mod, toate probele prelevate de la una şi aceiaşi persoană vor fi marcate cu codul unic al persoanei plus numărul necesar pentru identificarea probei particulare.
• Toate probele se plasează în tuburi. Marcajul de identificare: codul unic al persoanei + codul probei + informaţii despre tipul probei + data recoltării vor fi înscrise pe tub şi niciodată pe capacul sau ambalajul exterior al acestuia care pot fi schimbate în timpul manipulării. Pentru inscripţii se va folosi un marcher rezistent la alcool şi apă.

Probele care se vor preleva de la persoanele suspecte cu infecţia gripală A(H5N1) sunt:

1. Probe de referinţă:
   • Tractul respirator superior (se vor preleva ambele tipuri de probe pentru a permite detecţia H5N1 şi a altor viruşi gripali):
     • Tampoane faringiene posterioare (gât), în prezent sunt cele mai recomandate probe din zona tractului respirator superior pentru detectarea H5N1 (spre deosebire de gripa umană). Dacă este necesar, pot fi colectate tampoane nazo-faringiene.
     • Tampoane nazale cu secreţii nazale (din zona oficiului anterior al foselor nazale), aspirate sau tampoane nazo-faringiene reprezintă probe potrivite pentru detectarea gripei umane A şi B şi de aceia sunt utile în caz dacă gripa nu este provocată de H5N1.
   • Tractul respirator inferior:
     • Dacă pacientul este intubat, se va preleva un aspirat traheal sau se va recolta o probă în timpul lavajului bronhoalveolar.
   • Sânge:
     • Ser (acut şi convalescent dacă este posibil)
2. Probe secundare (nu sunt esenţiale, dar pot fi utile dacă există materiale disponibile)
   • Plasma pe EDTA - etilenediaminetetraacetic acid(pentru detectarea ARN viral);
   • Raclaj rectal – în special dacă pacientul are diaree;
   • Lichid spinal, dacă este suspectată meningita şi se execută o puncţie spinală în scop diagnostic/terapeutic.

Perioadele de timp (după declanşarea simptomelor de gripă) când se recomandă să se preleveze probe de la persoanele suspecte

1. Tamponul faringian posterior va fi prelevat (dacă este posibil) în decurs de trei zile după declanşarea simptomelor. Este necesar de menţionat, că virusul în general se identifică în tampoanele faringiene posterioare de la majoritatea pacienţilor din momentul apariţiei simptomelor (sau chiar puţin înainte) până spre sfârşitul celei de a doua săptămâni. Mai rar, începând cu săptămâna a treia de la debutul maladiei. Pentru cazurile ale căror probe iniţiale sunt negative pentru A/H5, dar care continuă să prezinte simptome caracteristice pentru această infecţie şi/sau au un istoric de expunere care susţine diagnosticul, li se va preleva probe repetate în cel mai scurt timp.
2. Virusul poate fi detectat în aspiratele traheale de la debutul simptomelor respiratorii inferioare (dispnee, respiraţie dificilă, tuse) sau a pneumoniei până în a doua sau a treia săptămână de boală.
3. Proba de ser din faza acută, trebuie să fie prelevată până la a şaptea zi de la debutul simptomelor (în mod obişnuit se prelevează când pacientul se prezintă la medic şi începe tratamentul), iar a proba convalescentă după 3-4 săptămâni.
4. Probe unice de ser. Se vor colecta în ziua 14 sau mai târziu după debutul simptomelor deoarece probabilitatea detectării anticorpilor neutralizanţi creşte în timp, în mod sigur de-a lungul primelor 3-4 săptămâni după debutul simptoamelor.
5. Serul sau plasma sanguină pentru detecţia ARN viral trebuie să fie prelevată în decursul primelor 7-9 zile după debutul simptomelor, deoarece e mai caracteristic ca pacientul în această perioadă să aibă ARN detectabil în sânge.
6. Probele primare (respiratorii şi sanguine) vor fi recoltate de la pacienţii suspecţi înainte de iniţierea terapiei antivirale, dar tratamentul nu trebuie amânat din motivul prelevării probelor. Trebuie de menţionat, că tratamentul standard poate aduce la probe negative prelevate din faringele posterior după trei sau mai multe zile de tratament, dar, probabil, nu are efect asupra dezvoltării anticorpilor neutralizanţi.
7. De la pacienţii decedaţi, probele vor fi recoltate cât mai repede posibil după deces.

Prelevarea probelor de la contacţi

Probabilitatea de a primi probe pozitive în cazul prelevării probelor unice de sânge sau a tampoanelor din tractul respirator de la contacţi care sunt sănătoşi în următoarele zile după contact este mică, de aceea se recomandă ca aceste persoane să fie ţinute sub observaţie în decurs de şapte zile de la ultimul contact, cu monitorizarea zilnică a temperaturii corpului. În cazul declanşării simptomelor caracteristice unei infecţii respiratorii, vor fi prelevate probe în conformitate cu recomandările prezentate mai sus.

Utilitatea prelevării probelor de sânge de la contacţi pentru studiile serologice este dictată de mai multe motive:

• ca un instrument pentru depistarea cazurilor asimptomatice/subclinice;
• pentru studierea prevalenţei a infecţiei A/H5N1;
• pentru evaluarea susceptibilităţii posibile la infecţia A/H5N1.

Probele pentru diagnosticul de laborator a gripei aviare trebuie să fie colectate în următoarea ordine de prioritate:

• Aspirat nazofaringian
• Ser acut
• Ser convalescent

Probele destinate detecţiei directe a antigenilor virali prim metoda imunofluorescentă trebuie refrigerate şi procesate în decurs de una-două ore de la recoltare. Probele colectate pentru izolarea viruşilor trebuie refregirate imediat după colectare şi inoculate în culturile de celule potrivite cît de repede este posibil. În cazul în care probele nu pot fi prelucrate în decurs de 48-72 ore, ele trebuie congelate şi stocate la temperatura de minim –70 0C.

Probele colectate din tractul respirator inferior sau superior trebuie să fie colectate şi transportate în mediu de transport pentru viruşi.

Stocarea probelor

În tabelul de mai jos sunt prezentate condiţiile termice de stocare şi de transportare care pot fi utilizate în dependenţă de tipul probei şi scopul investigării (bazate pe probabilitatea de obţinere a unui rezultat pozitiv pentru A/H5N1).

MTV – mediu de transport viral; PCR – reacţia de polimerizare în lanţ.
IR = insistent recomandată; A = metoda adecvată; NR = nerecomandată; N/A = neaplicabilă
* pentru stocare până la 7 zile; ** când nu este disponibilă congelarea la temperaturi de -70°C ; *** pentru stocare până la 4 zile.

• Porţiuni de probe vor fi prelevate înaintea congelării acestora.
• Congelarea şi decongelarea repetată a probelor va fi evitată pentru prevenirea pierderii infectivităţii virale. Anumite tipuri de congelatoare, denumite “fără gheaţă” (“frost free”) trebuie evitate deoarece ciclurile de variaţie a temperaturii implicate în menţinerea lor fără gheaţă poate afecta probele.
• Dacă probele destinate pentru izolarea virală (în MTV sau ser/plasma sanguină) vor ajunge în laborator în decurs de 48-72 ore, ele vor fi păstrate la temperatura de 4°C şi congelate la -70°C, dacă vor fi stocate până când vor puntea fi transportate la laborator. Congelarea la -20° C nu este recomandată deoarece virusul nu supravieţuieşte bine la această temperatură, în special în congelatoarele de tip - “fără gheaţă”.
• În lipsa congelatoarelor (sau a MTV), tampoanele conservate în etanol reprezintă o posibilă alternativă. Stocarea acestor probe la temperatura de +4°C (într-un frigider standard) este mai bună decât la temperatura camerei.
• Probele de ser sanguin trebuie să fie congelate la temperatura de -70°C pentru PCR şi la -20°C sau mai jos pentru determinarea titrului de anticorpi, dar pot fi stocate şi la temperatura de +4°C pentru aproximativ o săptămână.
• Probele pentru izolarea virusului gripal trebuie păstrate sau transportate în gheaţă uscată (dioxid de carbon solid) decât în cazul în care sunt sigilate în sticlă sau în pungi de plastic duble. Dioxidul de carbon poate inactiva rapid virusul dacă are acces la probe (notă: nu sigilaţi nici un container cu gheaţă uscată înăuntru deoarece poate exploda).

Transportarea probelor Către laboratoarele externe

Ambalarea şi transportarea probelor către laboratoarele externe prin intermediul transportului aerian este complexă şi este dirijată prin intermediul normelor internaţionale şi naţionale şi a variaţiilor operatorii.

Despre regulile OMS de Transportare a Substanţelor Infecţioase (Guidance on regulations for the Transport of Infectious Substances (WHO/CDS/CSR/LYO/2005.22)) vă puteţi informa accesând:
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2005_22/en/index.html

iar cu cele de stocare şi transportare a probelor recoltate de la oameni şi animale pentru diagnosticul de laborator în cazul suspecţiei infecţiei de gripă aviară (WHO guidelines for the storage and transport of human and animal specimens for laboratory diagnosis of suspected avian influenza A infection) accesând:
http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/transport/en/index.html